LAPORAN PCR
PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI
OLEH
BUDIONO
B1D014049
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS MATARAM
2011
PENDAHULUAN
Latar belakang
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan
dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik
atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan
organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan
waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh
hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak
dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan
hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai polimerase",
PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR
memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk
diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu.
Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi,
atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat
digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan
dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada
organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya
sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut
dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur
yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang
pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C,
yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan
penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan
terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida
primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas
tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang
ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin.
Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu
pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase.
Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan.
Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA
atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai
cetakan pada siklus selanjutnya.
Tujuan dan Manfaat Praktikum
Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum yaitu :
- Untuk
mengetahui takhnik dan cara melakukan PCR
- Untuk
memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.
- Digunakan
dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi
sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies
secara molekuler
Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum yaitu :
- Mahasiswa
dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel,mengetahui
alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalm mengetahui
proses dalam melakukan PCR.
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM
Materi Praktikum
Alat dan Bahan Praktikum.
Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :
-
Mesin PCR
- Elektroforesis
- Transiluminator
sinar UV
- Mikrowave
- Sisir
gel
- Mikro
pipet
- Tabung
ependorf
- Gloves
(sarung tangan)
- Parafilm
- Timbangan
analatik
Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :
-
Air steril
: 6,7 µl
- 10 x
buffer TAQ : 1 µl
- 2,5 Mm
dNTP mix : 0,4 µl
- 10 µM
primer foward : 0,4 µl
- 10 µM
primer reverse : 0,4 µl
- Template
: 1 µl
- Enzim
: (0,1 µl )/(10 µl)
Metode Praktikum
Adapun
metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :
- Mengambil
air steril sebanyak 6,7 µl dan dimasukkan dalam tabung PCR
- Menambahkan
10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam tabung PCR
- Menambahkan
2,5 mM dNTP mix sebanyak 0,4 µl
- Menambahkan
10 µM primer forward sebanyak 0,4 µl
- Menambahkan
10 µM primer reverse sebanyak 0,4 µl
- Menambahkan
template 1 µl
- Menambahkan
enzim polimerase sebanyak 0,1 µl
- Setelah
itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam mesin PCR yang sebelumnya
sudah diatur programnya.
- Hasul
PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis
- Menambahkan
looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang
gel 1 – 4, tunggu selama 10 menit
- Kemudian
diamati di transimlator sinar UV.
Tempat dan Tanggal Praktikum
Tempat
Praktikum
Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi
dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Mikrobiologi Fakultas Peternakan
Universitas Mataram.
Tanggal Praktikum
Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar
Bioteknologi ini pada hari Rabu, 23 November 2011.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Praktikum
Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang
gel 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif dan negatif. Dimana positif
berwarna merah sedangkan yang negatif berwarna biru. Seperti yang terlihat pada
gambar dibawah ini.
Pembahasan
Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial.
Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk
ekstrapolasi kembali untuk menentukan kuantitas awal dari urutan target yang
terkandung dalam sampel. Karena inhibitor dari reaksi polimerase ditemukan
dalam sampel, keterbatasan reagen, akumulasi molekul pirofosfat, dan self-anil
dari produk mengumpulkan, reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan
target pada tingkat eksponensial dan "dataran tinggi efek" terjadi,
membuat titik akhir kuantifikasi produk PCR dapat diandalkan. Ini adalah
atribut yang membuat PCR Real-Time RT-PCR kuantitatif sangat diperlukan.
DNA template - sampel DNA yang berisi urutan target. Pada awal reaksi, suhu
tinggi diterapkan untuk molekul DNA beruntai ganda yang asli untuk memisahkan
alur dari satu sama lain.
DNA
polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai DNA komplementer baru ke urutan
target. Yang pertama dan paling umum digunakan adalah enzim-enzim Taq DNA
polimerase (dari aquaticus Thermis), sedangkan PFU DNA polimerase (dari
Pyrococcus furiosus) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi
saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda, mereka berdua memiliki dua
kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR:
Mereka dapat menghasilkan untai DNA baru menggunakan
template DNA dan primer,
Mereka tahan terhadap panas
Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan
target. Polimerase dimulai sintesis DNA baru dari ujung primer.
Nukleotida (dNTP atau trifosfat deoksinukleotida) - unit tunggal dari basa
A, T, G, dan C, yang pada dasarnya "blok bangunan" untuk untai DNA
baru. RT-PCR (PCR Transkripsi Reverse) yang didahului dengan konversi PCR
RNA sampel ke cDNA dengan enzim reverse transcriptase.
Ada beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, antara lain
sebagai berikut :
-
Pada saat pengambila gel salah
- Pengambilan
frimer ataupun reverse tertukar
- Enzim
PENUTUP
Kesimpulan
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal
sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)
merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik
tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam
jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik
lain yang menggunakan DNA.
Dari lubang gel PCR 1-4 terdapat 2 lubang yaitu positif
dan negatif. Dimana positif berwarna merah sedangkan yang negatif
berwarna biru.
Ada beberpa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya
PCR yaitu :pengambilan gel yang salah, pengambilan primer / reverse tertukar ,
dan enzim.
No comments:
Post a Comment